亚克隆
亚克隆（英语：Subcloning）是一种分子生物学技术，涉及将目的片段（如基因、启动子等）导入目标载体中，以便进行进一步研究。该技术不仅包括传统的PCR技术和内切酶（限制酶）酶切方法，还包括了一种新兴的、操作简便且快速的Infusion技术。
基本介绍
亚克隆技术主要应用于细胞培养和分子克隆。在细胞克隆中，亚克隆是指从原有的克隆中筛选出具有某种特性的细胞进行培养。而在分子克隆中，亚克隆涉及从大片段的克隆中选取特定小片段进行再克隆。这是因为初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的脱氧核糖核酸片段，因此需要将目的基因所对应的一小段DNA找出来。对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆的目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：
1. 目的DNA片段和载体的制备；
2. 目的DNA片段和载体的连接；
3. 连接产物的转化；
4. 重组子筛选。
传统的亚克隆方法主要基于PCR技术和内切酶酶切。首先，使用限制酶将目的基因切下并纯化，通常通过胶回收的方式。然后，通过PCR制造一定数量的目的基因拷贝。同时，需要用相同的限制酶切割载体，以产生与目的基因互补的黏性末端，便于后续的脱氧核糖核酸连接酶连接。在此过程中，磷酸酯酶（如小牛肠道碱性磷酸酶CIAP）也是必不可少的，因为它能去除DNA链5'端的磷酸基团，防止载体自身黏合。形成的目的载体带有两个缺口，在转化入感受态细菌后能被感受态细菌自行修复。之后，再对目标载体进行分离/纯化。将目的基因与载体混合，并添加DNA连接酶，通常目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1，以避免数量过量造成的不利影响。目的基因也不应过长，超过10kb的话，将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚。
除了传统方法，Infusion技术作为一种较新的亚克隆技术，提供了一种更为简便快速的操作方式，能够实现传统方法难以做到的亚克隆。
亚克隆技术的实际应用广泛，例如，可以将目的基因导入大肠杆菌表达载体中，如pUC9，以研究该基因在大肠杆菌中的作用。或者，为了研究某启动子的控制作用，可以将其插入特定的载体中进行进一步研究。
限制性内切酶是一类能识别双链脱氧核糖核酸分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪力基因片段的重要工具，是亚克隆技术中不可或缺的一部分。