防御素
防御素（defensins），亦称为防御肽，是一类含有多个二硫键的阳离子多肽。它们在真菌、植物和动物界中广泛存在，并在生物的免疫系统中扮演着关键的调节角色。防御素不仅参与免疫调节，还具有显著的直接杀菌作用，因此它们被视为一类重要的抗菌肽，在生物体的天然免疫防御机制中发挥着至关重要的作用。
物理性质
防御素是一类分子很小（15-20残基）、富含半胱氨酸的阳离子蛋白质，属于抗微生物肽的一类。它们一般由15-20个氨基酸残基组成，包括6至8个保守的半胱氨酸残基。
分布范围
天然的防御素广泛分布于从植物、低等动物到哺乳动物等几乎所有的生物类群，它们是生物在与疾病长期斗争中通过进化而形成的，构成了生物自身防御体系的一个重要部分。这些防御素大多数与其他蛋白质一样，由特定的基因编码，因此可以通过基因工程技术进行研究和生产。基因工程的应用使得我们可以更有效地开发和利用防御素，以增强生物体的天然免疫防御能力。
研究历史
1966年，美国科学家Zeya和Spitznagel在哺乳动物老鼠和豚鼠类的多形核嗜中性白细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽，当时将其命名为“溶酶体阳离子蛋白”。这些物质后来被广泛认知为防御素。截至目前，研究者们已经鉴定出超过四百种不同的防御素。1985年，加利福尼亚大学的Robert Lehrer博士首次使用“防御素”（defensins）这一术语，并报道了兔子的防御素MCP-1和MCP-2能够直接中和并灭活流感病毒科和单纯疱疹病毒。紧接着第二年，他的研究团队又报道了人体内的三种alpha防御素（Human α-defensin或human neutrophil peptide, HNP）能够中和流感病毒、巨细胞病毒、水泡性口炎病毒等。
2002年，美国洛克菲勒大学艾伦·戴蒙德艾滋病研究中心的华人科学家张林琦在《SCIENCE》杂志上发表了重要文章，揭示了人体内T淋巴细胞分泌的α-防御素能够抑制艾滋病病毒的复制，这一发现为艾滋病的控制与治疗提供了新的研究路径，引起了生物医学界的极大关注。
从2003年开始，和仕康公司的核心研发团队在构建海洋生物如海马的cDNA文库过程中发现了大量的防御素基因，并成功分离出五种天然防御素。从2007年起，他们利用南海海洋生物技术国家工程中心等科研转化平台，将防御素发酵制剂作为饲料添加剂进行了大量的动物实验。实验结果显示，这种制剂能够显著提高动物的免疫力和防病抗病能力，为防御素在农业和兽药领域的应用提供了有力的科学依据。
分类
哺乳动物类防御素
防御素是动物体内重要的防御系统成分，它们主要由29至42个氨基酸残基组成，含有3对分子内二硫键，相对分子质量在2至6千约翰·道尔顿之间。根据二硫键的连接位置，防御素可以分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三类。
α-防御素是在1980年由美国Lehrer实验室首次从兔肺巨噬细胞中分离得到的一类强阳离子性小分子抗菌肽，最初命名为defensin，后归类为α-防御素。这类防御素主要分布在人、兔、猪、鼠类的嗜中性粒细胞中，以及兔子的齿槽巨噬细胞和人类及啮齿动物的小肠潘氏细胞中。α-防御素分子内的二硫键连接位置为Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5，其中Cys1-Cys6连接N端和C端，形成分子的大环结构。
β-防御素是由Diamond等人在1991年首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的，后来在牛粒性白细胞中发现了13种与其序列高度相似的防御素。由于它们的共有序列与α-防御素不同，因此被命名为β-防御素。这类防御素主要分布在牛的骨髓以及人及其他多种动物（如牛、羊、猪、骆驼、驯鹿、小鼠、大鼠）的胃肠道、呼吸道、舌、牙龈、肾、皮肤的上皮中。最近，在梅花鹿舌粘膜的上皮细胞内也发现了β-防御素。虽然单核细胞和巨噬细胞通常不表达防御素，但它们可以释放诱导上皮细胞合成β-防御素的信号。β-防御素分子内的二硫键连接位置为Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。
θ-防御素是在2002年由Trabi等人使用反向高效液相色谱法从猕猴的白细胞中分离出来的一种环状结构分子，也被称为猕猴θ型防御素-1（RTD-1）。这类防御素主要分布在巨噬细胞内。θ-防御素的结构与α和β-防御素不同，其前体（已发现3种）是α-防御素类似物，由一个终止密码子从α-防御素三个半胱氨酸碳骨架的第4个残基处截断，从而形成一个截短的α-防御素前体，然后通过剪切去掉一个9个氨基酸的片段，直到形成相同的或相似的九肽。成熟的θ-防御素是两个半防御素的修饰与结合产物，其前体（称为半防御素）是由变异的α-防御素基因和一个未成熟的终止密码子编码的产物，导致每个前体只包含3个半胱氨酸残基。θ-防御素分子内的二硫键连接位置为Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6，形成环状结构。
昆虫类防御素
在1988年，Masturyama在一种半翅目昆虫——肉蝇中发现了第一种昆虫防御素。随后，Dimarcq等研究人员从果蝇中分离出了一种病原菌诱导的抗菌肽，即果蝇的防御素。他们发现果蝇的防御素基因是单拷贝的，并且没有内含子，这一发现使得他们推测昆虫的防御素可能是通过独立进化途径产生的。
进一步的研究揭示了昆虫防御素与哺乳动物防御素在二硫键的连接方式以及它们的三维空间构型上存在显著差异，这证明了昆虫防御素和哺乳动物防御素并不具有同源性。大多数昆虫防御素带有单个净正电荷，分子量大约为4千约翰·道尔顿，由34至51个氨基酸组成。这些防御素的分子结构包括3个分子内二硫键形成的β片状结构和1个α螺旋结构，二硫键的连接方式为Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6。这些结构特征使得昆虫防御素在抗菌防御机制中具有独特的作用。
植物类防御素
在1990年，Mendez等研究人员从小麦和大麦种子中首次分离得到了植保素r1-P和r1-H。通过使用核磁共振光谱法（NMR）测定了它们的三维结构，发现这些植物防御素的结构与哺乳动物和昆虫防御素相似。这一发现为防御素在不同生物界中的存在和功能提供了新的见解。
近期，Thevissen的研究通过比较植物和昆虫防御素与真菌的葡糖苷鞘氨醇的相互作用，推断它们可能是由同一个前体细胞祖先进化而来的。这表明防御素在生物进化过程中具有古老的起源和保守的功能。
植物防御素的分子质量通常小于5千约翰·道尔顿，由45至54个氨基酸组成。它们的结构特征包括3个分子内二硫键形成的反向β片状结构和1个α螺旋结构。植保素含有4对二硫键，其连接方式为Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6、Cys4-Cys7。这种独特的结构使得植物防御素在植物抵御病原体侵害中发挥着重要作用。
生物活性
抗菌作用
防御素是一种高效的抗菌分子，能够有效地杀灭革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。在体外实验中，防御素在浓度为10～100 mg/L时就能对多种细菌产生杀伤作用。而在中性粒细胞中，防御素的浓度可达到g/L级别，远高于体外实验的浓度，这表明在体内环境中，防御素可能具有更强的杀菌活性。研究发现，防御素对革兰阳性细菌的杀伤能力通常强于对革兰阴性细菌的杀伤能力。
例如，HBD-2（人类β防御素-2）对大肠杆菌的半数致死量（LD50）为0.46 nmol/ml，最小抑菌浓度（MIC）为15 μg/ml，而对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC则为62 μg/ml。体外实验显示，大多数防御素的MIC范围在0.5-10 μmol/L。
关于防御素的抗菌活性机制，主要观点认为与其对微生物细胞膜的作用有关，可分为以下三个阶段：
1. 静电吸引：防御素带有正电荷，可以通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合。
2. 通道形成：带正电荷的防御素分子或多聚体与细菌质膜上带负电荷的磷酸甘油酯头部和水分子相互作用，显著增加生物膜的通透性，并在膜上形成稳定的多个通道。
3. 内容物外泄：通道形成后，防御素进入细胞内，同时其他胞外分子（如肽、蛋白质或无机化合物离子）也进入细胞内，而靶细胞的重要物质（如盐离子和大分子）渗出，导致靶细胞发生不可逆损伤而死亡。
此外，防御素还能通过诱导细胞因子的释放和介导非成熟性的树突状细胞协同刺激分子的表达上调，促进IDC（免疫树突状细胞）的成熟，进而活化T细胞，触发特异性免疫应答。这表明防御素不仅直接具有抗菌作用，还能参与调节免疫系统的功能。
抗病毒作用
防御素不仅对细菌具有杀灭作用，还能对抗一些包膜病毒，如HIV、疱疹病毒科、水泡型口炎病毒等，但对无衣壳病毒则不起作用。θ-防御素还具有抗滤过性病原体和抗毒素的作用。在体内实验中，防御素显示出能够延缓或根除兔梅毒病，并使兔牙周炎龈下菌群恢复正常的功能。
防御素抗病毒的作用机理主要是通过与病毒外壳蛋白结合，导致病毒失去生物活性，这种特殊的作用方式使得微生物难以对其产生抗性。防御素的抗病毒效果取决于防御素的浓度、分子内二硫键的紧密程度以及多种因素，如时间、pH值、离子强度和温度。在中性及低离子强度条件下，防御素表现出较强的抗病毒活性，而实验体系中加入血清或血清蛋白可能会显著降低防御素的抗病毒效果。
防御素的抗病毒作用机理可以概括为以下三点：
1. **闭门羹**：防御素阻止病毒入侵宿主细胞。病毒感染细胞的过程通常分为两步：首先是病毒包膜粘附到细胞膜上，然后是病毒包膜与细胞膜融合，使病毒的遗传物质进入细胞。防御素通过阻止病毒与细胞糖蛋白的结合，从而阻止病毒进入细胞内部。
2. **突破口**：防御素带正电荷，可以吸附到带负电的病毒囊膜和糖蛋白上，导致病毒囊膜穿孔，内容物外泄，从而使病毒死亡。
3. **地雷阵**：如果病毒已经进入细胞内，防御素可以与细胞膜上的多种分子结合，如促肾上腺皮质激素(ACTH)、人硫酸肝素糖蛋白(HSPG)、低密度脂蛋白受体(LDLR)等，激活细胞内的信号传导途径，如同在细胞内布置地雷，阻止病毒基因复制与转录，从而摧毁病毒。
这些作用机理说明了防御素在抗病毒防御系统中的重要作用，以及它们如何通过不同的方式来保护宿主免受病毒侵害。
细胞毒作用
防御素对正常和恶性哺乳动物细胞都表现出非特异性的细胞毒作用，但在对淋巴细胞和实体瘤细胞的杀伤作用上更为显著。特别地，防御素对一些特定的肿瘤细胞系，如抗TNF的U9TR细胞、抗NK细胞细胞毒因子的小鼠淋巴瘤YAC-1细胞和人组织细胞淋巴瘤U937细胞，显示出较强的杀伤能力。
在体外实验中，HNP（人α防御素）能够抑制辅酶I（NADPH）氧化酶的活性。HNP的细胞毒活性部分依赖于靶细胞膜脂质成分的代谢活性，并且能够与过氧化氢酶协同诱导细胞毒作用。通过体外观察纯化防御素对人类和小鼠肿瘤细胞的杀伤作用，发现防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞均具有细胞毒作用，并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。
这些研究表明，防御素在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值，特别是在增强传统化疗药物的疗效方面。防御素通过多种机制，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和干扰肿瘤细胞的新陈代谢，来发挥其抗肿瘤作用。然而，防御素在临床应用前仍需要进一步的研究和开发，以确定其安全性和有效性。
免疫调节作用
防御素不仅在直接抵抗病原菌方面发挥着重要作用，而且还在免疫调节方面显示出其多方面的功能。通过细胞信号传递机制，防御素能够增强非特异性免疫细胞的活性和趋化性，特别是对巨噬细胞的影响显著。它们能够促进机体T细胞的趋化和增殖，从而增强免疫应答能力，并调节特异性免疫，以增强生物体的主动防御功能。
防御素能够作为一种效应分子，激活巨噬细胞、树突状细胞（DC）、气管上皮细胞等细胞表面的受体，从而启动获得性免疫系统，并将先天性免疫和获得性免疫有机地连接起来。已经证实，一些α-防御素、β-防御素对T细胞、单核细胞以及未成熟的DC具有趋化活性，能够诱导单核细胞和上皮细胞产生细胞因子。
此外，人、鼠、猪、兔的中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒并释放组胺，而β-防御素通过与人趋化因子受体6（CCR6）结合，吸引不成熟的DC和记忆T细胞（Tm）至炎症部位，激活细胞免疫和体液免疫。防御素还能直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚，从而增强局部免疫反应。
综上所述，防御素在免疫系统中扮演着多方面的角色，包括直接抗菌、激活免疫细胞、促进免疫应答和调节免疫平衡等，它们在维持生物体的健康和抵御病原体侵袭中发挥着至关重要的作用。
应用
医学领域
与口腔黏膜疾病的关系
作为机体天然免疫系统的重要组成部分，防御素家族在口腔黏膜宿主防御和免疫应答过程中扮演着关键角色，与多种口腔黏膜疾病的发生发展密切相关，如口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等。目前，关于防御素在口腔黏膜疾病中的研究还处于初级阶段，主要集中在体外实验上，其作用机制多为推测。
对于防御素在体内的具体作用、潜在的毒性或其他不良反应等方面的研究相对较少，因此需要进一步的全面和多层次研究来探讨防御素在口腔黏膜疾病发生发展过程中的具体作用及其机制。这将有助于为口腔黏膜疾病的预防和治疗提供新的策略和见解。随着研究的深入，防御素在口腔健康维护和疾病治疗中的应用潜力将得到进一步的发掘和利用。
与炎症性肠病的关系
克罗恩病（Crohn's disease, CD）是一种慢性炎症性肠病，可影响消化道的任何部位，其特征是炎症的反复发作和缓解。CD的发病机制涉及遗传和环境因素的相互作用。肠道防御素是一类由肠道上皮细胞产生的多肽，它们在肠道中起着抵御外来病原体的重要作用。
在外阴克罗恩病患者中，特别是在回肠段的病变患者中，肠道防御素HD-5和HD-6的表达水平明显降低。这种变化与NOD2基因的突变有关，NOD2是一种参与识别细菌细胞壁成分并激活免疫反应的受体。然而，在放射性肠炎组织中，没有NOD2突变的克罗恩病患者HD-5和HD-6的表达水平反而升高，这表明HD-5和HD-6在克罗恩病不同病变部位的表达模式可能存在差异。HD-5和HD-6水平的降低可能会影响肠道黏膜的天然屏障功能，导致细菌附着并引发进一步的损害。
溃疡性结肠炎（Ulcerative 结肠炎, UC）通常在欧美国家较为常见，但近年来在中国也有显著增加的病例报道。UC主要影响结肠，正常人的结肠黏膜很少表达HD-5和HD-6，而在UC患者中，这两种防御素的mRNA表达水平显著高于正常人。此外，HBD-1在肠道上皮细胞中持续表达，不受外界因素影响，具有基础防御功能。然而，在UC和CD患者的放射性肠炎黏膜组织中，HBD-1的基因表达水平有所降低，这可能会降低肠道黏膜的抗菌活性，从而增加细菌入侵和引发炎症反应的风险。
在UC患者的病变结肠组织中，HBD-2可以被诱导性表达，而HBD-3的表达水平与HBD-2存在一定的相关性，在UC时表达也有明显增加。此外，HBD-4 mRNA的表达水平在UC肠上皮细胞中也明显增高。这些发现表明，不同类型的防御素在UC和CD中可能具有不同的表达模式和功能，这为理解这些疾病的发病机制和探索新的治疗策略提供了重要线索。
与慢性阻塞性肺部疾病的关系
慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）是一种以气道受限和慢性炎症为特征的呼吸系统疾病，其患病率和病死率都相对较高。呼吸道感染是COPD发病和病情加剧的一个重要因素。HBD-2（人β防御素-2）与呼吸系统疾病密切相关，它在肺部黏膜的防御中扮演着重要角色。
研究表明，当HBD-2的产生或作用受到抑制时，机体更容易发生肺部感染。这表明人为补充外源性防御素可能有助于防止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实，重组HBD-2能够对肺损伤产生保护作用，减少铜绿假单胞菌感染大鼠肺组织的菌落数。
在COPD患者中，气道、肺实质和肺血管均存在炎症，而肺上皮细胞中高表达的HBD-2能够通过调节肺部炎症因子，阻止全身性炎症反应（Systemic Inflammatory Response 综合征, SIRS）甚至多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction SynDROME, MODS）的发生和发展。此外，重组HBD-2还能够调控脓毒症诱发的肺组织细胞的过度凋亡，减轻肺组织损伤，保护肺功能。
这些研究表明，HBD-2在COPD的预防和治疗中具有潜在的应用价值，尤其是在减少呼吸道感染和减轻肺部炎症方面。然而，关于HBD-2在COPD中的作用机制和临床应用仍需要进一步的研究和验证。
临床药用研究
防御素因其广泛的抗菌谱、特殊的抗菌机理以及微生物难以产生抗药性，因此在药物开发领域具有巨大的潜力。2008年，全球首款防御素药物（PMX-30063）在加拿大完成了第一期临床试验，该药物对十余种耐药菌显示出显著的疗效。针对由金黄色葡萄球菌引起的急性细菌性皮肤感染这一适应症，该药物已完成了第二期临床研究。
PMX-30063的作用机制是通过直接靶向细菌细胞膜来达到杀菌的目的，这种机制使其不会产生耐药性。这为解决日益严重的细菌耐药性问题提供了新的希望。随着研究的深入和临床试验的进展，防御素药物有望成为对抗多重耐药菌的有效手段，为临床治疗提供新的选择。
食品工业
防御素因其优异的热稳定性，被认为是一种理想的食品防腐剂，适用于热加工食品的防腐保鲜。这种特性使其能够在高温加工过程中保持活性，从而延长食品的保质期。此外，防御素还能在巴氏杀菌后用于防止食品的再次污染，进一步加强食品的卫生安全。
畜牧业
抗生素添加剂在动物养殖中的广泛使用对动物肠道微生态平衡造成了严重破坏，同时药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康。相比之下，来自哺乳动物的防御素具有较小的相对分子质量、良好的热稳定性和水溶性，这些特性使得防御素能够在肠道内被吸收。由于防御素是一种多肽成分，在体内容易被Caspase-3降解为氨基酸，因此在动物采食后通常不会在体内残留。
通过基因工程技术生产环保型防御素饲料添加剂，或通过在日粮中添加防御素，都可以调控防御素基因的表达并实现其多种功效。这些功效包括减少死胎、木乃伊及残疾的发生；提高仔猪的初生重和出生均匀度；提高仔猪的断奶重、断奶成活率，并降低哺乳期仔猪的发病率；降低哺乳母猪的发病率，减少母、仔猪的应激；改善母猪的亚健康状态和繁殖障碍，延长母猪的使用年限；提高保育猪的成活率，降低发病率；提高保育猪的日增重，降低料肉比；改善免疫抑制，提高免疫应答能力，使抗体水平更加整齐。这些应用表明，防御素在动物养殖中具有重要的应用前景，有助于提高养殖效率和畜产品的质量。
农业
防御素在农业领域的应用主要集中在农作物抗病育种研究中，旨在通过建立防御素生物反应器，大规模生产并提纯防御素蛋白，从而培育出具有抗病性的新品种。研究者已经将兔防御素NP-1转入小麦植株，并在田间进行抗病虫鉴定。结果显示，转基因小麦对白粉病、叶锈病和条锈病的抗性显著增强。此外，将兔防御素NP-1基因构建到植物表达载体中，获得转基因番茄植株的抗病实验也取得了成功，表明这些植株对番茄青枯病具有抗性，为番茄的抗病育种工作奠定了基础。
这些研究进展表明，防御素在农业抗病育种中具有潜在的应用价值，能够提高作物的抗病能力，减少农药的使用，从而促进农业的可持续发展。随着研究的深入，防御素在农业中的应用范围和效果有望进一步扩大。
制备
防御素的获取主要依赖于三种途径：从细胞或体液中提取、化学合成以及通过基因重组表达与纯化。由于防御素在组织中的表达量通常较低，且纯化工艺的复杂性和成本较高，因此基因工程制备方法成为大量生产防御素的首选。
基因工程技术通过分子改造将防御素基因导入酵母等微生物中，实现其在大规模发酵过程中的重组表达。这种方法可以显著提高防御素的产量和活性，从而有效地对抗病原菌。通过这种方式，可以大规模生产防御素，满足其在医学、农业和其他领域的应用需求。随着基因工程技术的发展，未来可能会有更多高效、经济的防御素生产方法被开发出来。
应用前景
由于传统抗生素的副作用以及耐药菌株的日益增多，人们正在积极寻找替代品。防御素作为一种新型生物活性肽，其抗菌谱广泛，与抗生素通过阻断大分子生物合成来发挥作用的机制截然不同。防御素能够快速杀灭多种病原微生物，并且作为机体自身产生的一种活性物质，相对不具有免疫原性，对其产生抵抗性的细菌较少，病原菌也不易对其产生耐药性。因此，防御素有望成为替代抗生素的一种广谱高效的抗菌药物。
随着生物技术的飞速发展，新的防御素基因不断被发现，防御素家族的研究也在不断深入。高效表达系统和生物反应器的不断更新为防御素的工业化生产提供了可能。这些进展预示着防御素将成为新一代抗菌药物，为人类的生活带来更多的价值。随着研究的深入和技术的进步，防御素有望在未来的医疗和农业领域发挥重要作用，为解决抗生素耐药性和环境污染等问题提供新的解决方案。
参考资料
STTT:汪以真/王福俤综述防御素的研究现状与未来.网易.2024-08-25
一类新型的抗菌活性肽-生物防御素(Defensin).科学网.2024-08-25
人β防御素2与口腔扁平苔藓相关性的研究进展.医脉通.2024-08-25
浙大团队30页综述一文讲透:防御素与宿主健康 | 热心肠日报.腾讯网.2024-08-25
中性粒细胞防御素与肺部疾病的研究进展.丁香园.2024-08-25