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基因编辑

基因编辑

基因编辑（gene editing），又称基因组编辑（genome editing），是指一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术，利用该技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的脱氧核糖核酸片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。

自1865年，格雷戈尔·孟德尔（Mendel）发现遗传规律后，人们对遗传与生命的探索不断深入。二十世纪中期，赫尔希（Alfred Hershey）验证了DNA是生物的遗传物质，沃森和弗朗西斯·克里克提出的DNA分子双螺旋结构模式，人们对生命的认识进入到了分子水平，随后研究人员通过同源重组来提高突变率，经过努力又发现了归巢核酸内切酶（meganuclease）以及逐渐迭代了基因编辑技术——锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs，第一代）、转录激活样效应因子核酸酶（transcription 激活剂like effector nuclease ，TALEN，第二代）和核糖核酸引导的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR，第三代）/Cas9核酸酶。

基因编辑及其技术在医疗、农业、生物学研究等领域有广泛的应用和前景，例如药物靶标基因筛选、基因治疗、构建动物模型、作物品种优化等等。

同时基因编辑技术中人类胚胎基因编辑也一直是舆论关注和争论的焦点，在人类基因编辑技术应用于临床治疗与辅助生殖时，会面临不同于传统医疗手段的可控性风险，相应的风险控制措施也可能会产生更高的合法性、公平性等伦理争议。

定义

基因（遗传因子）是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核首酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。而基因编辑，是一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术，利用该技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的脱氧核糖核酸片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。在技术实时过程中，高效的基因组编辑是在感兴趣的染色体序列中产生靶向DNA双链断裂（Double strand breaks，DSB），触发DNA损伤反应（DNA damage response，DDR），启动非同源末端连接（Nonhomologous end joining，NHEJ）或同源定向修复（Homologydirected repair，HDR）程序，而最终实现基因敲除（Gene knockout）与敲入（Gene knockin）。

原理

基因编辑技术的原理是利用核酸内切酶能够识别并切断目的DNA序列造成DNA双链断裂（double strand breaks，DSBs），进而引发生物体基因组的自主修复机制来实现对目的脱氧核糖核酸序列进行遗传改造操作。

生物体修复DSBs主要有2种途径：一是非同源末端链接（non-homologous end joining，NHEJ）修复途径，这样的修复途径是在没有修复模板基因的时候引发的，此时有很大的概率产生插入缺失突变，造成整个基因发生移码突变，从而失去原有的功能，这样的基因编辑技术通常称为基因敲除（knock-out）。二是同源重组（homologousrecombination，HR）修复途径，这种途径是在有修复模板基因即与目的DNA两侧同源的供体DNA板（双链质粒或是单链DNA）生物体时启用的会按照供体DNA模板来修复目的基因序列，可以将研究者设计的供体基因插入到目的位点，这样的基因编辑技术称为基因敲入（knock-in）。

简史

早期探索

遗传规律的认识

人们对遗传规律和生命的探索可以追溯到十九世纪六十年代，1865年，格雷戈尔·孟德尔提出的基因分离定律和基因自由组合定律，揭示了遗传最基本的规律。1909年，托马斯·摩尔根发现遗传连锁定律，丰富了人们对遗传规律的认识。1952年，阿尔弗莱德·赫尔希（Alfred Hershey）和他的学生玛莎·蔡斯（Matha Chase）通过放射性同位素标记的 T2 噬菌体增殖试验，进一步验证了DNA是生物的遗传物质。次年，沃森和克里克利用富兰克林（R. Franklin）X射线衍射的资料，并结合自己的猜测才提出了提出的DNA分子双螺旋结构模式，使人们对生命的认识进入到了分子水平。

限制性内切酶的发现

二十世纪六十至七十年代，科学家逐渐认识到DNA对生物性状的决定性作用，DNA序列的改变，如碱基缺失、替换、插入等可能会引起表型的变化，或引发疾病。并且在研究细菌如何防御噬菌体过程中发现，限制性内切酶可以保护细菌免受噬菌体的侵害，随后人类对遗传性疾病基因治疗的探索带动了基因编辑的发展。1963年诺贝尔获奖者乔舒亚·菜德伯格（Joshua Lederberg）第一次提出了基因交换和基因优化的概念，想通过引入外源DNA进行基因修饰治疗人类遗传性疾病。1968年美国医师罗杰斯（Rodes）证明病毒可作为载体携带基因，1970年他应用含有精氨酸酶的乳头瘤病毒载体治疗一对姐妹精氨酸血症，但以失败告终。十年后，美国的克莱因（Cline）教授应用DNA重组技术将珠蛋白基因导入一个患有珠蛋白生成障碍性贫血的重症患者的骨髓细胞中，然后回到体内，但也失败了。

突破性进展

同源重组基因打靶

20世纪80年代发展起来了一项重要的分子生物学技术——同源重组，又被称为基因打靶或基因靶向技术，奠基了后续基因编辑技术的发展。其通过外源脱氧核糖核酸与染色体DNA之间进行同源重组使细胞中特定的基因失活（或缺失）或序列发生变化，从而达到精确的定点修饰和基因改造，具有定位性强、插入基因随染色体DNA稳定遗传等优点。1981年马丁（Martin）和埃文斯（Evans）等成功建立了小鼠胚胎干细胞系（ES细胞），使得基因打靶技术能够实际应用于转基因动物研究中。1985年，史密斯（Smithies）等首次利用同源重组方法将一段外源质粒插入到人染色体β-globin位点上，从而最早在哺乳动物细胞中实了同源重组。1988年，卡佩基（Capecchi）等运用“正负筛选”策略，将筛选标记基因neo和HSV-tk）装到打靶载体上，使中靶细胞的效率比仅使用单一正筛选标记提高了3~10倍。但基因靶向技术依旧有很大的局限性，不仅整合效率极低（整合效率取决于细胞的状态和类型），而且容易脱靶。

归巢核酸内切酶

20世纪七八十年代，由于发现了限制性内切酶脱氧核糖核酸连接酶和反转录酶等与基因治疗密切相关的关键酶，基因编辑技术进一步得到了关键发展。其中，八十年代末期，鲁丁（Ｒudin）等和鲁埃特（Ｒouet）等发现，在靶标位置引入双链断裂的DNA（double-strand break，DSB）会显著提高目的基因的整合效率。研究人员最早通过归巢核酸内切酶（也称大范围核酸内切酶）在基因组中引入特定的双链断裂DNA。归巢核酸内切酶能够识别14～40bp的NA片段，识别之后绝大部分可以通过非同源末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ）。人们在自然界中已经找到数百种归巢核酸内切酶，使用最广泛的主要有3种:Ⅰ-Sce、Ⅰ-Cre、Ⅰ-Dmo。然而，通过归巢核酸内切酶进行基因编辑也存在很大的制约性，例如适合靶向特定基因序列的归巢核酸内切酶的概率低、非同源末端连接修复脱氧核糖核酸双链断裂过程中不能引入外源的DNA模板等。

20世纪90代初，临床前疾病模型的成功建立，标志着基因治疗技术体系的初步建立，由此启动了病毒载体的基因治疗的临床试验。1985年，在非洲爪蟾卵母细胞中发现了第一个含锌指结合区域的转录因子皿。

技术迭代

21世纪初，科学家首次利用第一代基因编辑技术（ZFN技术）在非洲爪蛙卵母细胞内介导同源重组，第一代基因编辑技术的成功运用引起生命科学研究领域的广泛关注。其中，克卢格（Klug）等发现，锌指蛋白能够特异性识别3bp的脱氧核糖核酸序列，多个锌指蛋白可以组装成大复合物。金（Kim）等发现，内切酶FokⅠ具有独特的DNA识别域和切割域，在靶标位点进行同源二聚化以切割目的DNA片段。研究人员将FokⅠ的DNA识别域去除，将其切割域与锌指模块融合，命名为锌指核酸酶，锌指核酸酶技术被也被称为第一代基因编辑技术。

2009年，博赫（Boch）等发现，类转录激活因子蛋白可以识别DNA序列，因此出现了第二代基因编辑技术，其主要指转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN），碱基和一个TALrepeat（蛋白）结合，进入细胞除目标基因。

2012年，美国加利福尼亚大学伯克利分校的詹妮弗·杜德娜和瑞典于默奥大学的艾玛·纽埃尔·卡彭蒂耶共同完成了一种新的基因编辑技术——CRISPR/Cas9，标志第三代基因编辑技术产生。该技术与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统采用脱氧核糖核酸-核糖核酸结合的方式代替DNA与蛋白质的结合方式，该系统设计简洁、效率更高，使得哺乳动物基因编辑的成功率大大提升。

基因编辑技术方法

基于DNA内切酶实现基因组特定位点改造的基因编辑技术，是当前发展最为迅速的，关注度和应用范围最为广泛的一类基因编辑技术，包括三大基因编辑技术，即第一代的锌指核酸酶（锌fingernudease，ZFN）、第二代的转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease .TALEN）和第三代RNA引导的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9核酸酶技术。除此之外，基因编辑技术根据其原理还可分为，基于碱基互补配对能力和生物信息学传递中心法则的信息组修饰技术实现基因组多点修饰的基因编辑技术，如CAGE 和YOGE 技术；以及基于人工基因组设计合成的特定人工序列（LoxP 位点等）实现基因组多位点的删除、倒置与重复等编辑技术。

ZFN技术

第一代基因编辑技术是锌指核酸酶（锌-fingernudease，ZFN），其方法是找到基因位点和对应的蛋白质，对蛋白质的特定部分进行分析和设计（锌指），再将改造后的蛋白质送入细胞，这个细胞会从数万基因中找到目标基因，和目标基因结合。这项技术主要是为了敲除目标基因，让目标基因丧失功能。

首先ZFN由具有脱氧核糖核酸结合功能的锌指蛋白（zinc finger proteins，ZFPs）和Fok I限制性内切核酸酶这2部分构成。在整个作用过程中，其中ZFP构成DNA识别域来识别特定位点并与之结合，Fok I限制性内切核酸酶是来自海床黄杆菌的一种限制性内切核酸酶，它构成切制域来执行剪切功能。

其次，位点特异性是由组成其锌指蛋白基元（Motif）的种类及排列方式决定的，ZFN的DNA识别结构成是由3~６个Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别1个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白串联起来形成1个锌指蛋白组，识别一段在基因组中特异的碱基序列（9~12bp）。

最后，FokI限制性内切核酸酶只在二聚体状态下才有切制活性，需要在恰当的位置（识别位点相距4~7bp）设计2个单体的ZFN才能切脱氧核糖核酸，形成双链断随后引发生物体的自身修复功能实现对目的基因的定点改造。

优点与局限

ZFN技术的优点是锌指蛋白小，编码一对ZFN只需要大约2000bp序列，这样的蛋白容易通过腺相关病毒病毒载体导人生物体进行目的基因的剪切和编辑。但是ZFN技术存在很明显的缺点，它需要一个很大的锌指蛋白库才能做到靶向不同的基因序列，将锌指蛋白连接在一起时，它们之间会相互干扰，影响靶向结合DNA的特异性，导致ZFN容易脱靶。此外，ZFN具有细胞毒性，主要是非特异切割（脱靶切制）所带来的副作用，对其应用造成一些限制以及不确定性，特别是在涉及基因治疗等领域时，这一问题更为突出。

TALEN技术

TALE蛋白家族来自一类特殊的植物病原体一黄单胞杆菌（黄单胞菌属 spp.）。TALEN具体是由激活因子样效应物（TAL ffectors，TALEs）与Fok I限制性内切核酸酶的酶切活性结构域组合形成。其中，TALEs是由三个结构域组成：脱氧核糖核酸结合结构域、核定位信号（nuclear localization signal（s），NLS）和激活基因转录结构城（transcriptional activation 蛋白质结构域，AD）。在作用过程中，TALEs蛋白能够识别特异性DNA核苷酸碱基对，执行识别功能。如需进行基因编辑，如靶基因的敲除，需要将1对TALENs共转入细胞后，2个FokⅠ形成二聚体后在靶标位点剪切DNA，使DNA双链断裂，细胞通过非同源末端连接或同源定向修复DNA。在修过程中插入或删除部分碱基，造成移码突变，致下游一系列密码子改变，相当于敲除目的基因。与ZFN技术一致，需要在恰当的位置（识别位点相距4~7p）设计个单体的TALEN才能切DNA，形成双链断随后启动生物体的自身修复实现对目的基因的定点改造。

优点与局限

TALE重复单元识别的是单个碱基，相比于锌指核酸酶（ZFN）技术识别三个碱基具有更大的灵活性，能够向更长的基因序列，设计更简单，特异性相对较高。但TALEN技术也存在明显的缺点，TALEN具有一定的细胞毒性，模块组装过程烦琐，重复序列多而导致的分子克隆和构建载体困难。

CRISPR技术

CRISPR的全称是规律成簇间隔短回文重复，CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列（repeats）组成，重复序列的长度通常为21~48bp，重复序列之间被26~72bp间隔序列（spacer）隔开，CRISPR是细菌中存在的一种脱氧核糖核酸序列，首次发现是在乳酸菌里，在抗病毒感染的时候这种DNA序列会起作用，在乳酸菌感染病毒的时候，一些病毒的基因片段会保留在CRISPR序列中，当病毒第二次来袭，CRISPR就可以在Cas9酶的作用下，用保存的基因片段找到病毒基因，并且切断。这个机制类似于人体的免疫力，我们的机体会针对病毒产生抗体，类似地，乳酸菌这种功能使目标基因包裹在病毒上，然后产生对同种病毒的抵抗能力。在作用过程中，CRISPR这种种双链DNA核酸酶能够通过间隔序列（space）与目的基因进行识别，并在向导RNA引导下对目的基因靶位点进行切割。它与FokI限制性内切核酸酶功能类似，但它不需要形成二聚体才能发挥作用。

CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas系统的种类及组成成分较多，其中CRISPR/Cas9是目前最著名的CRISPRCas系统，其组成包括tracrRNA，crRNA和Cas9核酸酶。CRISPR/Cas9系统需要Cas9核酸酶和种向导RNA（guideRNA，gRNA）的共同作用才能发挥基因编辑功能。gRNA是一个从crRNA（CRISPRRNA）和tracrRNA（transactivating crRNA）的融合物构建而来的单一RNA嵌合体其5-末端有20个核酸的修饰可以指导Cas9到预定的切制位点。转录后，每个crRNA和tracrRNA结合在一起，并和Cas9核酸酶形成一个复合物。Cas9核酸酶在crRNA的指引下识别保守的间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）并靶向结合到脱氧核糖核酸上，产生特异性的DSBs，从而允许特异位点的基因编辑。研究证明，CRISPR/Cas9系统能在许多哺乳动物细胞和一此真核生物中诱导特定位点的靶向切割。

优点与局限

与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统采用DNA-核糖核酸结合的方式代替DNA与蛋白质的结合方式，该系统设计简洁、效率更高，使得哺乳动物基因编辑的成功率大大提升。CRISPR/Cas9技术的效率非常高，用于基因除的CRISPR载体构建极其简单，只需要根据推荐的序列合成spacer并将其整合进载体，就完成了基因编辑载体体外的操作过程，可以在3~4个星期内生产突变基因的小鼠，而传统的技术则需要长达几年的时间。作为一种新型的靶向基因编辑技术，CRISPR/Cas9与脱氧核糖核酸序列结合有更高的特异性，原因是ZFN和TALEN对靶DNA的识别是依靠蛋白质与DNA的相互作用其特异性相对较低而CRISPR/Cas9系统对DNA序列的识别是核糖核酸和DNA按照碱基互补配对原则进行的，因此特异性更高。从而该技术不存在动物物种的限制，已成功在细菌、斑马鱼、小鼠和大鼠等多个物种中得到广泛应用。

CRISPR/Cas9也有缺陷，最常发生的是“脱靶效应”，脱靶的意思就是打错了位点，理论上这个技术是精准的，但是少量的脱靶会让结果变得难以预料在癌症治疗方面，这种方法就遇到了阻碍，因为在癌症部位没有办法把脱靶的细胞剔除出去。目前因为单细胞比较好控制，大多数的试验还是集中在胚胎干细胞领域。

应用

基因编辑技术在基因功能研究、药物开发、疾病治疗和作物育种等方面有着重要意义和广阔的应用前景。基因编辑技术可以在全基因组范围进行基因功能研究，除此之外，该技术也被广泛应用于生物治疗及药物研究等领域。

医疗领域

药物靶标基因的筛选

基于全基因组的CRISPR技术敲除筛选可用于功能基因组学研究，通过该技术能够检测细胞耐药性的基因组位点，明确细胞如何诱导宿主免疫反应，阐明某些病毒如何诱导细胞死亡。此外，也可以利用基因编辑技术发现的功能性非元件。

基因治疗

基因编辑可以用来进行治疗疾病，简称基因治疗（gene therapy），是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段，是将人的正常基因或有治疗作用的基因，通过一定技术方式导入人体靶细胞内来纠正基因缺陷从而达到治疗作用。例如，研究人员利用ZFN技术得到了具有HIV抗体的人细胞和治疗HIV的药物。也有研究人员利用TALENs技术来治疗地中海贫血病，利用CRISPR/Cas9技术来对抗肿瘤，以及利用基因编辑技术恢复了肌营养不良蛋白基因的表达，拯救了杜氏肌营养不良症模型小鼠的肌肉功能。已有应用是CRISPR/Cas9技术来纠正遗传疾病基因。2016年，世界上第一例CRISPR/Cas9人体试验在中国四川大学华西医院启动，他们的攻克目标是肺癌。基因编辑技术在治疗一些人类遗传性疾病方面是很有前景的，但是作为一种新的治疗手段，还需要很多进一步的研究和验证来确保治疗的安全性。2024年3月20日，荷兰阿姆斯特丹大学的研究人员在近期举行的一次医学会议上表示，他们通过基因编辑技术成功切除了受感染细胞中的艾滋病毒。但这种技术还停留在“概念证明”阶段，真正应用于艾滋病治疗还需要很长一段时间。

基因鉴定

基因编辑技术用于必需基因及药物靶标基因鉴定，例如CRISPR/Cas技术能使目标基因表达量降为0，能更好地分析靶基因在生物体内的功能。

生物学研究

构建模式动物

基因编辑技术不受胚胎干细胞限制，效率高速度快，定点编辑更加准确，研究人员可以利用基因编辑复制出更多有助于研究疾病发生和药物筛选的动物模型。研究者已经在许多模式生物（兔子、大鼠）、大中型动物（猪、牛）中通过ZFN技术编辑某特定基因，从而实现基因敲除，利用CRISPR/Cas系统已经构建了携带特异性突变的小鼠。

TALENs也被用于一些人类细胞系中的目标基因位点，包括胚胎干细胞（hESC）和诱导多功能干细胞（iPSCs）。此外，因编辑技术也被运用到果蝇、蠕虫蟾蜂和斑马鱼中。利用基因敞除技术可以获得很多人类疾病模型，如小鼠糖尿病模型，p53基因除引起的肿瘤模型，以及很多免疫缺陷病模型。

农业领域

优化作物品种

基因编辑技术可以用于植物作物品种优化。CRISPR/Cas已经在多种模式植物和农作物中得到应用，植物基因功能挖掘、贮藏期的延长、风味的优化等都可通过CRISPR/Cas技术来实现。主要的基因编辑技术方法有农杆菌介导法和基因枪法。其中，农杆菌介导法是霍施（Horsch）等于985首创，基枪法由莱因（Klein）等于1987提出。在水稻育种方面，有研究人员利用CRISPR术获得了株高降低且有增产潜力的水稻材料，以及利用CRISPR技术敲除水稻中OsPAO5基因后，水稻籽粒显著增多，产量显著提高。也有研究表明，通过靶向水稻中一个调节粒型和株高的基因miＲ396，使之突变，突变体植株的籽粒变大、穗长增加，且在低氮条件下表现出高产稳产。

增强抗性

干旱、高温、寒冷、重金属污染等非生物胁迫对作物生长发育和产量有严重影响，可以通过基因编辑技术增强对农作物对非生物胁迫的耐受性。例如，镉是一种对人体有害的重金属，镉超标的大米是饮食上镉摄入的主要来源，科研人员通过基因编辑镉转运相关蛋白，筛选出耐镉的水稻品种；通过CRISPR技术编辑玉米中ARGOS8基因，增强玉米对干旱的抗性；通过改良的基因编辑技术敲除水稻相关调控基因microRNA166，增强水稻的抗旱性等。此外也可以利用基因编辑技术增强植物病虫害等生物胁迫的耐受性，例如有些科研人员利用基因编辑技术敲除调控稻瘟病菌的抗性基因OSERF922后，培育出抗稻瘟病的纯合突变株系；或通过编辑SWEET基因启动子区域培育出对牛百叶枯病具有广谱抗性的水稻品种等。

前景

基因编辑技术在基因功能研究、药物开发、疾病治疗和作物育种等方面有着重要意义和广阔的应用前景。例如在疾病治疗中，有可能通过修饰体细胞治疗个体自身遗传性疾病（如珠蛋白生成障碍性贫血）、治疗和预防个体自身基因引起的疾病《如癌症，乳腺癌和卵巢癌可敲除BRCA基因）、治疗和预防自身的感染艾滋病。在疾病预防中，有可通过生殖系（精子、卵子、胚胎）基因修饰使后代不患该家族的遗传病或其他与基因有关的疾病，预防各种烈性传染病癌症、心血管疾病等。2020年2月8日，在美国进行的一项临床试验显示，经过体外多次基因编辑的免疫细胞可在癌症患者体内存活数月，表明这种方法未来有望用于抗癌和治疗其他疾病。2024年3月20日，荷兰阿姆斯特丹大学的研究人员表示，他们通过基因编辑技术成功切除了受感染细胞中的艾滋病毒。若这种新技术能得到进一步发展，将有望清除人体内所有艾滋病毒，从而治愈艾滋病。

此外，还有可能通过基因编辑进行体质增强，使人获得预防人类免疫缺陷病毒感染的能力；将乌龟的长寿基因加在人类基因组内，可使人存活超过150岁，基因增强还可用于非医学目的。如改进皮肤、头发瞳孔颜色，提高身高，加强臂力，加强奔跑速度等。同样，在面对面对器官移植等疾病时，降低风险，如敲掉猪体内引发人体免疫反应的基因，删除猪体内若干反转录病毒等，可将猪器官移至人体而不致引发免疫反应和跨特种感染此外，基因编辑技术还可应用于任何生物体。如利用基因编辑技术培养不会咬人的蚊子，不长象牙的大象，不长角的犀牛等。